La PCR en tiempo real (qPCR) es uno de los métodos más poderosos, sensibles y precisos para la cuantificación de ácidos nucleicos en biología molecular moderna. Desde el diagnóstico clínico hasta la investigación en genética, microbiología, oncología y virología, la qPCR se ha convertido en una herramienta indispensable para detectar y cuantificar ADN o ARN con exactitud y rapidez.

En este artículo encontrarás una guía completa, explicada con rigor técnico pero con un enfoque práctico, sobre cómo funciona la qPCR, cómo interpretar sus curvas y cuáles son los errores más comunes, especialmente útil para estudiantes, investigadores y técnicos de laboratorio.

1. ¿Qué es la PCR en tiempo real (qPCR)?

La qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) es una variante de la PCR tradicional que permite medir la cantidad de ADN amplificado en cada ciclo en tiempo real. Esto se logra mediante el uso de fluoróforos, cuyo nivel de fluorescencia aumenta proporcionalmente a la cantidad de ADN presente.

A diferencia de la PCR convencional, que solo muestra resultados al final mediante electroforesis, la qPCR permite:

• Cuantificación absoluta o relativa de ADN/ARN

• Monitorización continua del proceso

• Mayor sensibilidad, especificidad y rapidez

Es fundamental en áreas como:

• Diagnóstico molecular (virus, bacterias, mutaciones)

• Expresión génica mediante RT-qPCR

• Estudios de metagenómica y microbiota

• Validación de resultados de secuenciación

2. Principios fundamentales de la qPCR

2.1 Amplificación del material genético

La qPCR sigue las mismas fases de la PCR tradicional:

• Desnaturalización: separación del ADN (94–95°C)

• Alineamiento: unión de primers (50–65°C)

• Extensión: síntesis de nuevas hebras por Taq polimerasa (72°C)

2.2 Detección mediante fluorescencia

Durante cada ciclo, un sistema de detección mide la intensidad de fluorescencia, la cual aumenta a medida que se sintetiza ADN.

Existen dos sistemas principales:

✔️ a) qPCR con colorantes intercalantes (SYBR Green)

• Se une a cualquier ADN de doble cadena

• Es económico y fácil de usar

• Mayor probabilidad de generar señales inespecíficas

✔️ b) qPCR con sondas específicas (TaqMan, Molecular Beacons)

• Fluorescencia solo cuando la sonda es degradada

• Mayor especificidad

• Ideal para cuantificación precisa y multiplexing

3. Interpretación de curvas en qPCR

La correcta interpretación de los resultados es uno de los elementos más críticos en qPCR. Estas son las curvas clave:

3.1 Curva de amplificación

Es la curva principal y muestra el aumento de fluorescencia.

Fases de la curva:

1. Fase de base: señal baja y constante

2. Fase exponencial: duplicación del ADN en cada ciclo

3. Fase lineal: agotamiento de reactivos

4. Fase de meseta: no hay más amplificación útil

✔️ Ct o Cq (Cycle Threshold)

Es el número de ciclo donde la fluorescencia cruza el umbral establecido.

• Ct bajo = alta concentración de ADN

• Ct alto = baja concentración

Valores típicos:

• 12–20 → alta carga genética

• 20–30 → concentración media

• 30–35 → baja concentración

• 35–40 → señal dudosa o inespecífica

3.2 Curva de disociación (Melt Curve)

Se usa en qPCR con SYBR Green.

Permite verificar la especificidad del producto:

• Una sola “peaks” = amplificación específica

• Varias “peaks” = primers dímeros o productos inespecíficos

3.3 Curva estándar (Standard Curve)

Se usa para cuantificación absoluta o eficiencia de reacción.

Se construye con diluciones seriadas conocidas y permite calcular:

• Eficiencia (E%)

• R² de linealidad

• Rango dinámico

La eficiencia ideal es entre 90–110%, equivalente a un incremento de ~1.9–2.1 veces por ciclo.

4. Componentes esenciales para una reacción de qPCR

Una reacción exitosa requiere componentes de alta calidad:

5. Errores frecuentes en qPCR y cómo evitarlos

Dominar la qPCR implica minimizar errores experimentales que pueden afectar dramáticamente los resultados.

5.1 Errores en diseño de primers

Frecuente en principiantes y en trabajos rápidos.

Errores comunes:

• Primers demasiado cortos o largos

• Hairpins y dímeros

• Amplificación inespecífica

✔️ Solución: usar software especializado

• Primer3

• NCBI Primer-BLAST

5.2 Contaminación del laboratorio

La qPCR es extremadamente sensible; incluso trazas mínimas de ADN pueden generar falsos positivos.

✔️ Soluciones:

• Áreas separadas para preparación, pipeteo y análisis

• Filtros de aire HEPA

• Micropipetas dedicadas a PCR

• Tips con filtro siempre

5.3 Inhibidores en la muestra

Frecuentes en muestras ambientales, de sangre o alimentos.

✔️ Solución:

• Purificación adecuada del ADN/ARN

• Controles internos de inhibición

5.4 Mala eficiencia de amplificación

Si la eficiencia cae por debajo del 80 %, los resultados no son confiables.

✔️ Correcciones:

• Ajustar concentración de primers

• Optimizar MgCl₂

• Verificar calidad de la polimerasa

5.5 Problemas con las curvas de melt

Picos múltiples = mala especificidad.

✔️ Solución:

• Rediseñar primers

• Subir la temperatura de alineamiento

• Usar sondas TaqMan

6. Aplicaciones de la qPCR

La qPCR domina muchas áreas modernas de investigación y diagnóstico.

• Diagnóstico de virus (influenza, SARS-CoV-2, VIH)

• Detección de bacterias patógenas

• Cuantificación de expresión génica (RT-qPCR)

• Estudios de oncogenes y mutaciones

• Metagenómica y microbiota

• Control de calidad en biotecnología

FAQs sobre la qPCR

1. ¿Qué diferencia a la PCR de la qPCR?

La PCR convencional detecta el ADN al final del proceso; la qPCR lo hace en tiempo real y permite cuantificación.

2. ¿Qué Ct se considera positivo?

Depende del ensayo, pero generalmente <35. Entre 35–40 debe repetirse para confirmar.

3. ¿Cuál es la eficiencia ideal?

Entre 90 y 110 %.

4. ¿Es más precisa la qPCR con sondas TaqMan?

Sí. Evita amplificaciones inespecíficas comunes en SYBR Green.

5. ¿Qué significa una curva de melt con varios picos?

Indica presencia de productos inespecíficos o dímeros de primers.