La purificación de proteínas es uno de los procesos centrales en la bioquímica, la biotecnología y la biología molecular moderna. Gracias a ella, es posible aislar proteínas específicas a partir de células, tejidos o mezclas complejas, con el objetivo de estudiarlas, caracterizarlas o utilizarlas en aplicaciones industriales, farmacéuticas y diagnósticas. Aunque se trata de un procedimiento técnico, su importancia abarca desde la investigación académica hasta la producción de medicamentos como enzimas terapéuticas, anticuerpos monoclonales o proteínas recombinantes.

En esta guía completa exploraremos los principios fundamentales, los métodos tradicionales y avanzados, los equipos esenciales, así como los criterios que permiten seleccionar la técnica adecuada para cada tipo de proteína.

¿Qué es la purificación de proteínas?

La purificación de proteínas es el proceso mediante el cual se separa una proteína de interés del resto de biomoléculas presentes en un extracto biológico. Una muestra cruda suele contener:

• Lípidos

• Ácidos nucleicos

• Otras proteínas

• Sales

• Metabolitos

• Fragmentos celulares

El objetivo es obtener la proteína deseada con el máximo rendimiento y la máxima pureza, sin alterar su estructura o función biológica.

Principios clave de la purificación de proteínas

Antes de elegir un método, es necesario considerar varias propiedades intrínsecas de las proteínas:

1. Tamaño molecular

Proteínas pequeñas (10–30 kDa) requieren métodos distintos a proteínas grandes (100–300 kDa).

2. Carga eléctrica

La carga cambia con el pH; este principio se aprovecha en la cromatografía de intercambio iónico.

3. Hidrofobicidad

Determinante en técnicas como la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).

4. Solubilidad

La precipitación salina (sulfato de amonio) explota esta característica.

5. Afinidad específica

Algunas proteínas se unen a ligandos naturales o etiquetas (His-tag, GST, MBP).

6. Estabilidad térmica

Algunas proteínas pueden purificarse mediante calentamiento selectivo sin perder su función.

Estos principios permiten diseñar un flujo de purificación eficaz.

Métodos de purificación de proteínas

Aquí examinamos los métodos más utilizados, desde técnicas clásicas hasta procedimientos especializados avanzados.

1. Precipitación con sulfato de amonio

Es uno de los métodos más antiguos y económicos.

Cómo funciona

• Se agrega sulfato de amonio a la muestra.

• El aumento de fuerza iónica reduce la solubilidad.

• Las proteínas precipitan dependiendo de su hidrofobicidad.

Ventajas

• Económico

• Excelente primera etapa para eliminar grandes cantidades de impurezas

Desventajas

• No genera alta pureza

• Requiere pasos posteriores de cromatografía

2. Cromatografía de intercambio iónico (IEC)

Se basa en la carga neta de la proteína.

Tipos:

• Intercambio catiónico: proteínas cargadas positivamente

• Intercambio aniónico: proteínas cargadas negativamente

Ventajas

• Alta resolución

• Buen rendimiento

Limitaciones

• Requiere ajustar pH y fuerza iónica cuidadosamente

3. Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Separación basada en el tamaño.

Aplicaciones

• Determinación de oligomerización

• Purificación final («polishing step»)

Ventajas

• No altera la proteína

• Permite separar agregados

Desventajas

• Limitada capacidad de carga

• No genera grandes concentraciones

4. Cromatografía de afinidad

La técnica más poderosa y selectiva.

Ejemplos:

• Ni-NTA para proteínas His-tag

• GST para proteínas fusionadas

• Anticuerpo–antígeno

• Lectinas–glicoproteínas

Ventajas

• Alta especificidad

• Altísima pureza en un solo paso

Desventajas

• Costosa

• Riesgo de co-elución de contaminantes asociados al ligando

5. Electroforesis preparativa

Separación basada en movilidad eléctrica.

Útil para:

• Purificación de pequeñas cantidades de proteínas para estudios estructurales

6. Ultrafiltración y diafiltración

Se utilizan membranas con un peso molecular de corte (MWCO) específico.

Funciones

• Concentrar proteínas

• Intercambiar buffer

• Eliminar moléculas pequeñas

7. Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)

Ideal para proteínas con regiones hidrófobas expuestas.

8. Cromatografía por afinidad a metales inmovilizados (IMAC)

Utilizada en proteínas recombinantes con etiqueta His.

Metales comunes: Ni²⁺, Co²⁺, Zn²⁺.

Equipos esenciales para purificar proteínas

Los laboratorios modernos utilizan una combinación de tecnología manual y automatizada.

1. Centrífugas y ultracentrífugas

Para separar restos celulares tras la lisis.

2. Sistemas FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)

Permiten alta precisión y programación automática.

3. Columnas cromatográficas

Disponibles en diferentes materiales y capacidades.

4. Liofilizadores

Para conservar proteínas a largo plazo.

5. Baños fríos y cámaras refrigeradas

La mayoría de las proteínas son termolábiles.

6. Espectrofotómetros UV-Vis

Para medir concentración y pureza (especialmente a 280 nm).

¿Cómo elegir la técnica adecuada de purificación?

1. Conocer la fuente de la proteína

• Recombinante

• Tejido animal

• Cultivo bacteriano o fúngico

2. Considerar la cantidad necesaria

• Microgramos (uso analítico)

• Miligramos (bioquímica estructural)

• Gramos (industria)

3. Tener claro el nivel de pureza requerido

• Pureza de investigación: 85–95%

• Pureza clínica: >99%

4. Evaluar estabilidad y propiedades

Proteínas sensibles requieren condiciones suaves.

5. Seleccionar un esquema de purificación

Un flujo típico puede ser:

1. Lisis celular

2. Centrifugación

3. Precipitación (opcional)

4. Cromatografía de afinidad

5. Cromatografía de intercambio iónico

6. SEC como pulido final

7. Concentración y almacenamiento

Errores comunes en la purificación de proteínas

• No mantener temperatura constante de 4 °C

• Buffers incompatibles con columnas

• Usar velocidades de flujo demasiado altas

• No verificar el pH antes del proceso

• Sobrecargar la columna

• Agitar excesivamente, causando desnaturalización

Aplicaciones modernas de la purificación de proteínas

• Producción de anticuerpos monoclonales

• Obtención de proteínas recombinantes para vacunas

• Enzimas industriales y alimentarias

• Estudios estructurales (cristalografía, NMR, cryo-EM)

• Proteómica y biomarcadores

• Desarrollo de biosensores

FAQs sobre purificación de proteínas

1. ¿Qué pureza se considera aceptable para investigación?

Entre 85% y 95%, dependiendo de la aplicación.

2. ¿La purificación afecta la actividad de una proteína?

Sí, especialmente si se utilizan condiciones extremas de pH o temperatura.

3. ¿Qué método es mejor para proteínas recombinantes?

La cromatografía de afinidad IMAC suele ser el estándar.

4. ¿Qué hago si la proteína se precipita durante la purificación?

Ajustar pH, agregar glicerol, reducir temperatura o disminuir fuerza iónica.