La centrifugación es una de las técnicas fundamentales en cualquier laboratorio de biología molecular, bioquímica y biotecnología. Permite separar componentes celulares, macromoléculas o partículas en función de su tamaño, densidad y forma mediante la aplicación de una fuerza centrífuga. Entre las variantes más utilizadas se encuentran la centrifugación diferencial y la centrifugación en gradiente, dos métodos esenciales para aislar organelos, proteínas, virus, ADN y otros componentes celulares con alta eficiencia y pureza.

En esta guía completa aprenderás los fundamentos teóricos, los pasos del procedimiento, las ventajas de cada tipo de centrifugación y las aplicaciones más relevantes en biología molecular moderna.

1. Fundamentos de la centrifugación en biología molecular

La centrifugación se basa en que las partículas suspendidas en un líquido sedimentan cuando se someten a una fuerza centrífuga. La velocidad de sedimentación depende de:

• Tamaño de la partícula

• Forma

• Densidad

• Densidad del medio

• Velocidad de rotación (RPM o RCF)

La fuerza que actúa sobre las partículas se expresa como RCF (Relative Centrifugal Force):

RCF=1.118×10−5 (r) (RPM)2\text{RCF} = 1.118 \times 10^{-5} \, (r)\,(RPM)^2RCF=1.118×10−5(r)(RPM)2

Donde r es el radio del rotor, un parámetro clave para la sedimentación.

2. Qué es la centrifugación diferencial

La centrifugación diferencial es el método más básico y uno de los más utilizados para fraccionar componentes celulares. Se basa en aplicar una serie de centrifugaciones sucesivas con aumentos progresivos de velocidad.

✔ ¿Cómo funciona?

Cada velocidad sedimenta partículas de un tamaño y masa determinado:

• A baja velocidad → núcleos, restos celulares.

• A velocidad media → mitocondrias, lisosomas.

• A alta velocidad → microsomas, vesículas.

• A ultracentrifugación → ribosomas, virus, macromoléculas.

Es ideal para muestras complejas, como homogeneizados celulares o tejidos.

3. Pasos del procedimiento de centrifugación diferencial

Paso 1: Preparación del homogeneizado

Se rompe la célula mediante:

• Sonicación

• Lisis química

• Homogeneización mecánica

El objetivo es liberar organelos sin dañarlos.

Paso 2: Primera centrifugación (baja velocidad)

• 600–1,000 × g

• Sedimenta: núcleos y detritos grandes.

El pellet se descarta o se analiza según la finalidad.

Paso 3: Segunda centrifugación (velocidad media)

• 3,000–10,000 × g

• Sedimenta: mitocondrias, peroxisomas.

Paso 4: Tercera centrifugación (alta velocidad)

• 20,000–40,000 × g

• Sedimenta: microsomas, fragmentos de membranas.

Paso 5: Ultracentrifugación

• 100,000 × g o más

• Sedimenta: ribosomas, virus, vesículas extracelulares (EVs).

4. Ventajas y desventajas de la centrifugación diferencial

✔ Ventajas

• Simple y económica

• Requiere equipamiento básico

• Ideal para separar organelos grandes

• Rápida ejecución

✔ Desventajas

• Pureza limitada

• Co-sedimentación de partículas

• Difícil separación de componentes similares en tamaño

Por esto, se combina frecuentemente con centrifugación en gradiente.

5. Qué es la centrifugación en gradiente

La centrifugación en gradiente permite separar partículas según su densidad real, logrando altísima resolución y pureza.

Se utiliza un tubo que contiene un gradiente de densidades (generalmente sacarosa o cloruro de cesio), en el cual las partículas se posicionan en el punto donde su densidad coincide con la del medio.

Existen dos tipos principales:

✔ 1. Gradiente de velocidad de sedimentación (rate-zonal)

• Separa según tamaño y forma.

• Las partículas migran a diferentes velocidades a través del gradiente.

✔ 2. Gradiente isopícnico (de equilibrio)

• Separa según densidad.

• Cada partícula se detiene en el punto del gradiente donde su densidad es igual a la del medio.

6. Pasos del procedimiento en gradiente

Paso 1: Preparar gradientes

Métodos comunes:

• Gradiente escalonado

• Gradiente continuo

Concentraciones típicas: 10–60% de sacarosa.

Paso 2: Cargar la muestra cuidadosamente

Se evita mezclar el gradiente.

Paso 3: Centrifugación en ultracentrífuga

Puede durar entre 1 y 18 horas dependiendo del objetivo.

Paso 4: Recolección de fracciones

Se extraen por:

• Perforación inferior

• Punción con aguja

• Aspiración por capas

Paso 5: Análisis de las fracciones

Se evalúan por:

• Espectrofotometría

• SDS-PAGE

• Ensayos de actividad enzimática

• PCR o RT-qPCR

• Microscopía electrónica

7. Diferencias principales entre centrifugación diferencial y en gradiente

8. Aplicaciones en biología molecular

✔ 1. Aislamiento de organelos

• Mitocondrias

• Lisosomas

• Núcleos

• Cloroplastos

✔ 2. Purificación de virus

La centrifugación en gradiente permite separarlos por densidad.

✔ 3. Separación de vesículas extracelulares (exosomas)

Uso clave en estudios de biomarcadores.

✔ 4. Purificación de ADN y ARN

Especialmente con gradientes de CsCl.

✔ 5. Fraccionamiento proteico

Permite aislar complejos multiproteicos.

9. Errores comunes y cómo evitarlos

• No equilibrar los tubos → vibraciones peligrosas.

• Gradiente mal formado → separación deficiente.

• Sobrecarga de muestra → distorsiona resultados.

• Velocidades incorrectas → pérdida de organelos o ruptura.

• No controlar la temperatura → degradación de biomoléculas.

FAQs sobre centrifugación diferencial y en gradiente

1. ¿Qué tipo de rotor es mejor para estos métodos?

• Diferencial: rotor basculante o de ángulo fijo.

• Gradiente: rotor de ultracentrífuga, de ángulo fijo.

2. ¿Cuánto tiempo dura un gradiente estable?

Hasta 24 horas si se conserva a 4 °C.

3. ¿Qué medio es mejor para gradientes?

• Sacarosa: organelos y proteínas.

• CsCl: ácidos nucleicos.

• Percoll: células vivas.

4. ¿Se pueden combinar métodos?

Sí, lo más común es utilizar ambos para aumentar la pureza.